| Resumo: |
The mechanism that bivalve molluscs react to infectious agents are important research subjects in the fIeld of disease control studies for these animals. While the selection of disease resistant populations have made decisive progression in some species, the mechanism behinds these resistant phenomena is not yet clear so far. However, hemocytes must represent one of the key factors in the reaction process. Based on this hypothesis, the structure and function of European flat oyster, Ostrea edulis, hemocytes have been investigated in aid of different techniques in the present study. ln addition, Pacific oyster, Crassostrea gigas, hemocytes have been analysed in certain aspects so as to provide some results for comparison. European flat oyster and Pacific oyster hemocytes have been separated in three subpopulations corresponding respectively to granulocytes, large hyalinocytes and small agranulocytes by centrifugation in Percoll and Ficoll density gradient. These three separated hemocyte sub-populations as weil as the total hemocyte population demonstrate differences in electrophoretic patterns on SDS-PAGE. Differences in enzymatic activities have been revealed among total hemolymph, cell-free hemolymph, total hemocytes and separated hemocyte sub-populations and between Ostrea edulis and Crassostrea gigas. Bonamia ostreae infection induces enzymatic activity increase in the cell-free hemolymph fraction of its host. The hybridoma technique has been used for developing monoclonal antibodies specifically against Ostrea edulis hemocytes. One hybridoma clone (GP2,E11) which produces antibodies recognising all granulocytes was selected for application in granulocyte study. As a result, granulocyte tissue distribution and ontogenisis in developmental process of Ostrea edulis have been analysed by immunohistological technique in using antibody GP2E11. The antibody has also allowed to develop a procedure for analysing specifically labelled hemocytes with flow cytometry. Flow cytometric analyses of oyster hemocytes based on cellular autofluorescence in association with mitochondria membrane potential have made it possible to distinguish European flat oyster hemocytes into different sub-populations. However, this classification schema is independent to that defined by microscopic morphologic characteristics. The detection of hydrogen peroxide produced by hemocytes after stimulation shows variable results. On the other hand, the analyses of phagocytic ability and cellular viability by using fluorescent markers have proved that flow cytometry is ideal alternative for oyster hemocyte research in these aspects
Les mécanismes de défense mis en jeu par les mollusques bivalves vis à vis des agents infectieux trouvent leur importance dans les recherches fondamentales et appliquées développées pour lutter contre les maladies chez ces espèces. Bien que la sélection de populations résistantes à des infections ait été entreprise chez ces animaux, les bases des mécanismes de résistance restent encore obscures, à ce jour. Il est cependant certain que les hémocytes possèdent un rôle clé. Dans ce cadre, une caractérisation de la structure et des fonctions des hémocytes chez l'huître plate, Ostrea edulis, a été effectuée à l' aide de différentes techniques au cours de ce travail. Par ailleurs, certaines analyses ont porté également sur les hémocytes d' huître creuse, Crassostrea gigas, afin de disposer de points de comparaison. Les hémocytes totaux d'huître plate, Ostrea edulis et d'huître creuse, Crassostrea gigas, ont été séparés· en trois sous-populations distinctes correspondant respectivement aux granulocytes, grands hyalinocytes et petits agranulocytes par centrifugation en gradient de densité. L'analyse en SDS-PAGE de ces trois sous-populations cellulaires ainsi que celle des hémocytes totaux ont révélé des différences. Par ailleurs, les activités enzymatiques détectées au moyen du système API montrent des différences entre l'hémolymphe totale, la fraction acellulaire de l'hémolymphe, les hémocytes totaux et les sous-populations hémocytaires séparées chez Ostrea edulis et Crassostrea gigas. Par ailleurs, l'infection par le parasite Bonamia ostreae induit une augmentation des niveaux d'activités enzymatiques dans la fraction acellulaire. La technique de fusion lymphocytaire a été utilisée pour développer des anticorps monoclonaux spécifiques des hémocytes chez l'huître plate, Ostrea edulis. Un hybridome (GP2E11) produisant un anticorps spécifique des granulocytes a été sélectionné et a permis d'étudier cette population hémocytaire. Il a été ainsi possible d'observer une large distribution des granulocytes dans les tissus conjonctifs de différents organes chez des huîtres plates adultes. Par contre, l'utilisation de cet anticorps n'a pas permis de mettre en évidence de granulocytes au stade larvaire chez cette même espèce. Cet anticorps a permis par ailleurs de définir en cytométrie de flux des pourcentages de granulocyte pour des échantillons d'hémocyte d'huître plate, Ostrea edulis et d'huître creuse, Crassostrea gigas. Des analyses réalisées en cytométrie de flux sur la base de l'autofluorescence associées à un marquage des membranes mitochondriales a permis de séparer les hémocytes en populations distinctes chez l'huître plate, Cependant, le schéma de classification défini ne correspond pas à celui basé sur des caractères morphologiques. La caractérisation fonctionnelle des hémocytes d'huître plate, Ostrea edulis, entreprise en cytométrie de flux par le biais de la recherche d'une activité métabolique respiratoire faisant suite à une stimulation n'a pas permis de définir les niveaux de production de peroxyde d'hydrogène pour l'ensemble des animaux analysés. En effet, la variabilité individuelle dans ce cas fait que les réponses d'une huître à l'autre sont très différentes. L'analyse des capacités de phagocytose de billes de latex fluorescentes permet quant à elle de définir sans difficulté en cytométrie de flux des pourcentages de cellules à activité phagocytaire.
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